Behandling af sygdomme ved hjælp af CRISPR

Man har allerede i årtier kendt til teknikker, der kan bruges til at ændre på organismers egenskaber. Den insulin, diabetespatienter bruger til at behandle sig selv, kommer fx fra gensplejset gær, som er frembragt ved, at man har indsat et menneskeligt insulingen i gærceller, der som følge heraf laver menneskeligt insulin, man kan “høste”. Der er også udført genmodifikation på afgrødeplanter, såkaldte GMOer, som nu dyrkes i store dele af verden.

En udfordring med de teknikker, man har anvendt, er, at de er tids- og pengekrævende og upræcise. At de er upræcise betyder, at man ikke har fuld kontrol over, hvor mange ændringer, de foretager i arvemassen, og hvor. Det er en af grundene til, at man anser det for nødvendigt at gennemføre meget omfattende undersøgelser af fx GMOer, før myndighederne tillader, at de må dyrkes i stor skala.

Der er også gjort mange forsøg på at ændre på gener hos mennesker med sygdomsfremkaldende fejl i generne ved hjælp af genmodifikation (genterapi), men resultaterne var indledningsvis dårlige. I 2002 forsøgte man at genmodificere såkaldte “boblebørn”, dvs. børn der på grund af en mutation i et bestemt gen har et defekt immunforsvar. Defekten gør, at de må leve inde i en plastikboble, der beskytter dem imod kontakt med omgivelsernes sværm af mikrober – ubehandlet dør børnene i en tidlig alder.

Behandlingen virkede på mange af patienterne, men forsøget resulterede desværre – helt uforudset – i, at to af børnene samtidig fik kræft. Genet havde fundet vej til et såkaldt protoonkogen, dvs. et gen der kan udvikle sig til et kræftfremkaldende gen, hvis der opstår bestemte mutationer i det. I patienterne var dette gens regulering blevet forstyrret.

Det ærgrede mange forskere og patienter, at man tydeligvis ikke havde lige så meget styr på, hvad man gjorde, når man brugte genterapi, som man troede og håbede. Mange lande valgte at droppe behandlingstilbuddet om genterapi. De seneste 5-10 år er der dog gjort store fremskridt. I 2011 kom fx et gennembrud, da det lykkedes engelske forskere at behandle blødersygdom med genterapi. Denne og flere andre behandlinger er under udvikling og bliver til nye behandlinger i disse år – behandlinger der vel at mærke fjerne selve årsagen til sygdommene og dermed overflødiggør behovet for, at patienterne skal gennemgå yderligere behandling, indtage medicin, osv.

Usikkerhed om uventede ændringer i arvemassen er en væsentlig grund til, at man ikke har turdet afprøve genmodifikation på det befrugtede æg (zygoten – det første stadie i udviklingen af et embryon). For her ville eventuelle fejl følge barnet hele livet og desuden nedarves, da alle det udvoksede menneskes celler, inklusive sæd- og ægceller, er kopier af denne første celle. Det ville ellers være smart, for så ville man ikke have besværet med at dirigere genet hen til de syge celler – det ville være i alle cellerne helt fra undfangelsen.

Figuren viser, hvordan én celle udvikler sig og bliver til et barn.

I dansk lovgivning er det forbudt at frembringe et genmodificeret barn, bl.a. af frygt for at skadelige ændringer går i arv. Når man overhovedet turde gøre forsøget på boblebørnene, var det fordi behandlingen var på somatiske celler, dvs. celler hvis arvemateriale ikke nedarves, og fordi behandlingen kunne være livreddende.

CRISPR — på vej imod genmodifikation af mennesker

En ny teknik ved navn CRISPR/Cas9 – populært bare “CRISPR” (udtales “crisper”) – blev opdaget og udviklet i 2012. Som vi skal høre mere om neden for, døjer den nye CRISPR-teknologi med nogle af de samme problemer som traditionelle teknikker, dvs. der sker uventede ændringer i genomet – især taler man om såkaldte ”off-target” effekter, dvs. den ændring, man vil lave, sker flere steder, man ikke havde planlagt. Det diskuteres sågar, om CRISPR overhovedet er mere præcis end de “gamle” teknikker til at genmodificere, man har brugt i mange år. Men i og med at CRISPR-teknologien er så nem, billig og effektiv at arbejde med, har rigtig mange forskere kunnet kaste sig over arbejdet med at forfine teknikken, og derfor kan det være et spørgsmål om tid, før teknikken er præcis nok til, at man vurderer det sikkert nok at afprøve den på menneskelige embryoner (på éncellestadiet, dvs. zygoten).

I det følgende skal vi se nærmere på, hvordan CRISPR-teknologien mere konkret kan bruges, hvis man vil ændre på generne hos fx et menneske.

Figuren viser de tre “hovedpersoner” i CRISPR-komplekset.

1. En ”saks” (Cas9, et såkaldt restriktionsenzym) der kan klippe DNA over.
2. En ”sporhund” i form af et stykke DNA (crRNA), der kan finde det stykke DNA (target DNA), man vil ændre i (fx et sygdomsgen). Det kan det, fordi det har en sekvens der matcher (=er komplementær med) den sekvens, der skal ændres.
3. Et bindeled (tracerRNA) der binder sporhunden/crRNA og saksen/Cas9 sammen, fordi den er komplementær med crRNA i den ene ende og binder til Cas9.

Hvad er CRISPR/Cas9?

CRISPR-systemet er et kompleks, som består af tre forskellige molekyler, der tilsammen kan finde og klippe et bestemt sted i et stykke DNA. Det er denne evne til at klippe meget præcist, der gør teknikken meget brugbar.

Dette samlede “CRISPR-kompleks” er med andre ord en målrettet saks. Hvor komplekset laver et brud afhænger af crRNA sekvensen, for det er den, der finder hen til den sekvens i modtagerens arvemasse, den matcher med. Noget af det epokegørende ved CRISPR er, at forskerne i dag ret nemt kan designe crRNA, og dermed styre saksen lige der hen i arvemassen, de vil. Dermed kan de undgå, at et nyt gen indsættes i og ødelægger vitale gener, sådan som det skete med boblebørnene.

Figuren viser, hvordan man kan slukke gener (knock-out – venstre del af tegningen) eller indsætte nye gener (knock-in – højre del af tegningen) ved hjælp af CRISPR.

1. Forskning: knock out af et gen gennem dobbeltstrenget brud efterfulgt af ikke-homolog sammenføjning – en klodset reparation der ofte ødelægger genet
2. Genmodifikation: knock in af et gen – indsættelse af et nyt gen (transgenet – blå på tegningen) gennem dobbeltstrengede brud efterfulgt af homolog rekombination. I trin 1 sker bruddet. Forskeren tilsætter det gen, der skal indsættes, og i trin 2 ser man, hvordan cellen indsætter transgenet for at “lukke” bruddet. Det sker ved at de frie ender bliver sat sammen med transgenets frie ender, hvilket forskeren kan fremprovokere ved at sørge for, at de frie ender (grå på tegningen) på transgenet er homologe med det sted i target DNA, hvor genet skal indsættes. I trin 3 er begge transgenets ender blevet koblet sammen med den brudte DNA-streng, og der er dermed blevet indsat et nyt gen i modtagerens genom.

Hvordan kan et brud på DNA-strengen bruges til at genmodificere mennesker?

Sagen er, at når der sker brud i en celle, vil den automatisk forsøge at reparere DNA-strengen ved hjælp af reparations-mekanismer, celler naturligt har. Det kan ske på to forskellige måder med meget forskellige konsekvenser, der er brugbare på hver deres måde (se figur herunder).

• Knock-out. Reparationen kan ske ved såkaldt ikke-homolog sammenføjning (non-homologous end-joining), som dog ofte efterlader et “ar” i form af insertioner eller deletioner (forkortes tilsammen “indels”). Indels midt i et gen kan forstyrre eller helt ødelægge genet, hvilket kan være interessant set ud fra et forskningssynspunkt – man kan bruge det til målrettet at slukke for at gen (”knock-out”) for at studere dets funktion
• Knock-in af transgen. Hvis formålet er at lave en målrettet reparation af et defekt gen eller måske at indsætte et nyt gen (“knock-in”), skal man i stedet have cellen til at bruge såkaldt homolog rekombination. Cellen kan reparere brud ved at sætte dem sammen med andre DNA-stumper, hvis sekvenser matcher (er komplentære med) de frie enders sekvenser. Hvis man tilfører det gen, man vil indsætte (transgenet), flankeret af sekvenser der er komplementære med de frie ende efter bruddet, kan cellen finde på at reparere bruddet med det nye gen.

Risici ved at genmodificere ved hjælp af CRISPR

CRISPR/Cas9-teknikken kan lyde avanceret, men teknikken er faktisk langt nemmere og mere effektiv at anvende end tidligere teknikker. Heri kan en af de største farer vise sig at ligge: At en teknik, der fundamentalt ændrer på levende organismers egenskaber, bliver så tilgængelig, at det bliver vanskeligt at kontrollere, hvem der bruger den og under hvilke forhold.

Men selv hvis CRISPR-teknikken bruges under kontrollerede forhold, rejser spørgsmålet sig, om teknikken er sikker nok til, at det er forsvarligt at tage den i anvendelse – på mennesker med sygdom eller på befrugtede æg?

Forskerne er særligt optaget af, at Cas9 har det med at klippe andre steder end der, hvor man planlagde. Derfor har man indtil videre kun turdet afprøve teknikken på celler uden for menneskekroppen, fx i forbindelse med stamcellebehandling. Her kan man nemlig undersøge, hvilke celler der fungerer, som de skal, før man eventuelt fører dem tilbage ind i kroppen.

Hvad kan genmodifikation af embryoner reelt bruges til?

Kunstig befrugtning er netop et eksempel på behandling af menneskeceller uden for kroppen. Her befrugter man et æg, udtaget fra mor, med sædceller fra far. Det er muligt på dette stadie at genetisk modificere det befrugtede æg (zygoten) og derefter undersøge, om modifikationen er foregået som planlagt, før man lægger den genmodificerede zygote op i livmoderen. Det er lovligt i Danmark at genmodificere zygoter, men ikke at lade dem udvikle sig udover de første 14 dages udvikling – eller til fødsel af genmodificerede mennesker.

Sygdomsbehandling

Men hvorfor ikke, spørger nogen? Mange anser muligheden for at helbrede arvelig sygdom som det tungeste argument for at genmodificere embryoner.

Til det formål findes dog allerede teknikker, som allerede bruges. Kun i sjældne tilfælde er såkaldt ægsortering ikke tilstrækkelig (se boks).

Der er forskellige fordele og ulemper ved at bruge ægsortering eller genmodifikation:

• Vælger man genmodifikation, behøver man i princippet kun at bruge ét befrugtet æg, men der kan som nævnt være en vis risiko for, at der sker uintenderede ændringer
• Vælger man ægsortering, skaber man flere zygoter, så chancerne for at der kan findes en zygote uden et sygdomsgen er tilpas store. De resterende zygoter destrueres, hvilket af nogle anses som et etisk problem.

Forbedring – genetisk vaccination og præstationsforbedring

Mange finder det mere bekymrende, at genmodifikation kan noget, man ikke kan allerede, nemlig at indsætte helt nye gener i et embryon. På den måde kan man forbedre på menneskers gener, enten i zygoten (hvorved ændringen vil være arvelig) eller senere (hvorved ændringen kun vil påvirke de celler, der behandles). Man kan måske se for sig, at det engang vil blive sådan, at når en kvinde alligevel er i gang med at gennemgå kunstig befrugtning, vil hun også få et tilbud om at få “optimeret” nogle gener? Omkring 10 % af alle børn undfanges ved kunstig befrugtning. Hvis risikoen ved genmodifikation kan begrænses, kan det godt tænkes, at nogen ville overveje at genmodificere på det befrugtede æg.

Der har været snakket meget om at designe “supermennesker”; men ikke nok med, at de fleste af etiske grunde tager afstand fra at ændre på sådan noget som intelligens eller humør – det er også rent teknisk svært og måske slet ikke muligt, fordi sådanne egenskaber er genetisk komplekse og kræver ændring af mange gener – med uforudsigelige konsekvenser.

Genetisk vaccination imod sygdom?

Det er nok mere sandsynligt, at man i første omgang vil forsøge sig med simple ændringer, fx ændringer der gør mennesker mere robuste over for sygdom. Og det er faktisk allerede muligt. Fx ved man, at visse afrikanske kvinder er resistente over for HIV. Det skyldes en bestemt mutation i genet CCR5. Hvis man nu overførte dette gen til andre mennesker, ville de have en slags “genetisk vaccination” imod HIV.

Meget tyder på, at der findes beskyttende gener over for mange forskellige sygdomme. Fx er der fundet en beskyttende variant af genet CD33, der er associeret med demens. Særligt spændende ville det naturligvis være, hvis man fandt genvarianter, der gør mennesker mere robuste end gennemsnittet over for hyppige sygdomme som diabetes eller kræft.